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Zaitsu* et al., Analytical Chemistry 2016; Y. Hayashi, K. Zaitsu* et al., Analytica Chimica Acta 2017; K. Zaitsu* et al. Analytical Chemistry 2018; K. Zaitsu* et al. Analytical Chemistry 2020; K. Hisatsune, K. Zaitsu* et al. ACS Omega 2020.) 本手法は極細針を対象成分のサンプリングとイオン化に用いるため、前処理が不要で、わずか数μLの試料量でも分析が可能です。 そこで、マイクロダイアリシス法で得られた灌流液をPESI/MS/MSで分析できるか検討しました。灌流液に用いる人工脳脊髄液（aCSF）にグルタミン酸およびGABAを添加し、PESI/MS/MSで分析を行いました。条件検討の結果、図2に示すような操作フローに従って、定量分析法を構築しました（図２）。 1検体当たりの分析時間は僅か30秒であり、検量線はグルタミン酸、GABAのいずれも良好な直線性を示しました。また、日内および日間における定量精度・再現性が高いことも示されました。特に、本手法ではaCSFを、たった3µL使用するだけでグルタミン酸とGABAの濃度を迅速に測定できます。これはマイクロダイアリシスの灌流液の流速を仮に3 µL/minに設定した場合、1分ごとに灌流液を回収するだけでよく、脳内のグルタミン酸とGABAの濃度変化を1分ごとに観測できるということを意味します。 図１　PESI/MS/MSの外観 図２ 定量分析の操作フロー IS：内部標準物質. 次に、本分析法の実用性を評価しました。マウスの線条体に外科手術によりマイクロダイアリシス法の微小透析膜が付いたプローブを留置し、自由行動下で一定時間aCSF液を灌流させた後、高濃度カリウムイオンを含む灌流液(High-K+液)を灌流させることで、脱分極8を誘導した際のグルタミン酸とGABAの濃度変化を観察しました。ここでは灌流液の流速を3 µL/minとし、5分毎あるいは1分毎に灌流液を回収し、測定を行いました。図3および図4に結果を示します。 図3および図4に示すように、5分ごとに採取したデータ、1分ごとに採取したデータのいずれにおいても、High-K+液に灌流液を切り替えた直後にグルタミン酸の濃度が上昇し、その後、濃度が減少する傾向が観察されました。また、グルタミン酸濃度の上昇よりも少し遅れてGABAの濃度が上昇する傾向も観察されました。 そこで、これらの時系列データをマウスごとに解析するために、ベイズ統計モデリングによる状態空間モデルを応用しました。ここでは、aCSF液を灌流した際の定常状態の濃度（図3では0-25分、図4では0-9分の値）を用いて状態空間モデルより95%信用区間を算出しました。この95%信用区間は図3および図4に青色の帯でそれぞれ示しています。 図3に示す5分ごとの時系列データでは、High-K+液の灌流による脱分極の結果、グルタミン酸およびGABAは95%信用区間よりも高値を示すことが示されました。しかし、図3a-1に示すように、1匹のマウスではグルタミン酸は65分の時点で95%信用区間より低値を示したのに対し、図3b-1に示す別のもう1匹のマウスでは、95%信用区間より低値を示しませんでした。 一方、図4a-1および図4b-1に示す1分ごとの時系列データでは、2匹のマウスにおいて、グルタミン酸は脱分極によって95%信用区間よりも高値を示したのち、この信用区間よりも低値まで下がることが確認できました。この結果、1分ごとに採取したデータの方が、より詳細に脳内の神経伝達物質の挙動を観察できていることが示されました。 また、図3および図4に示したいずれのマウスにおいても、High-K+液を灌流している間、GABAの濃度は95%信用区間よりも高値を示し続けました。従って、本手法を用いることで線条体におけるグルタミン酸とGABAの取り込み機構の差異を詳細に観察できることも示されました。 以上の結果、本研究では自由行動下のマウス脳内神経伝達物質の挙動をわずか1分ごとに観察する手法の開発に成功しました。また、マイクロダイアリシス法から得られた時系列データにベイズ統計モデリングによる状態空間モデルを初めて適用し、その実用性を示すことにも成功しました。 図３　マウス線条体のL-GluとGABAの5分ごとの変化. ５分毎に灌流液を回収し、グルタミン酸（a-1およびb-1）とGABA(a-2およびb-2)の濃度を測定した結果。図中の黒下線部はHigh-K+液を灌流液として流した時間域を示す。*：状態空間モデルより算出した95%信用区間外の値であることを示す。#：検出下限と定量下限の間の範囲にある値を示す。 図4　マウス線条体のL-GluとGABAの1分毎の変化. 1分毎に灌流液を回収し、グルタミン酸（a-1およびb-1）とGABA(a-2およびb-2)の濃度を測定した結果。図中の黒下線部はHigh-K+液を灌流液として流した時間域を示す。*：状態空間モデルより算出した95%信用区間外の値であることを示す。   今後の展開 本手法をアルツハイマー型認知症やパーキンソン病をはじめとする病態モデルマウスの解析に応用することで、各病態における神経伝達物質の挙動をより詳細に追うことができるようになると期待されます。特に近年、高い注目を浴びている認知症治療薬の開発における治療効果への応用や薬剤応答性の評価などへの応用が期待されます。 さらに今後、測定対象成分を神経伝達物質以外のものにも拡張することに加え、マイクロダイアリシス法とPESI/MS/MSをオンラインで接続するためのデバイス（現在、特許出願中）を用いることで、脳内生体分子の変化をリアルタイムに測定できる「in vivoリアルタイム脳計測システム」によって、秒単位で脳内分子の変化を観察できる技術の開発を目指します。   発表雑誌 掲雑誌名：Talanta 論文タイトル：Rapid quantification of extracellular neurotransmitters in mouse brain by PESI/MS/MS and longitudinal data analysis using the R and Stan-based Bayesian state-space model 著者：Daisuke Kawakami a,b, Mitsuki Tsuchiya a, Tasuku Murata b, Akira Iguchi c, Kei Zaitsu a,d,* 所属：a Department of Legal Medicine & Bioethics, Nagoya University Graduate School of Medicine, 65 Tsurumai-cho, Showa-ku, Nagoya, 466-8550, Japan b Shimadzu Corporation, 1, Nishinokyo-Kuwabaracho Nakagyo-ku, Kyoto, 604-8511, Japan c Geological Survey of Japan, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, Ibaraki, 305-8567, Japan d In Vivo Real-time Omics Laboratory, Institute for Advanced Research, Nagoya University, Furo-cho, Chikusa-ku, Nagoya, 464-8601, Japan DOI： 用語説明 1. 微小透析法（マイクロダイアリシス法） 微小透析膜のついたプローブをマウスの脳内などに外科手術で埋め込み、人工脳脊髄液などを灌流して神経伝達物質などの脳内分子を回収する方法。自由行動下のマウスから脳内分子を回収し、脳内での挙動を観察できることが特長。[参照元へ戻る] 2. 探針エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（PESI/MS/MS） 探針エレクトロスプレーイオン化法 (Probe Electrospray Ionization) は、2007 年に山梨大学の平岡賢三 教授が開発したイオン化法であり、先端直径 700 nm の微細針を用いて試料の採取とイオン化を行うことが可能である。タンデム質量分析 (MS/MS)は、質量分析計の質量分離部に「四重極型」と呼ばれる質量分離部を直列に 3 つ接続した装置で行う分析手法を指す。MS/MS により二段階の質量分離が可能となるため、イオン化した対象成分の特異的な検出が可能である。PESI と化合物の同定能力の高いタンデム質量分析（MS/MS）を組み合わせることで、前処理操作を行うことなく、臓器内の対象成分を直接検出することが可能である。2016 年に財津准教授らの研究グループが PESI/MS/MS を用いた代謝物分析法を世界で初めて報告した。[参照元へ戻る] 3. 神経伝達物質 神経細胞の軸索末端から放出され、標的とする細胞の興奮や抑制を伝達する化学物質のこと。興奮性の神経伝達物質としてグルタミン酸、抑制性の神経伝達物質としてGABAが有名である。[参照元へ戻る] 4. 時系列データ 一定時間ごとに得られた測定値を時間的な順序に沿って並べたデータを指す。相互の測定値間に統計的な依存関係が認められることが多いため、一般的に取り扱うデータとは異なり、時間軸に沿って並んだ順番を考慮したデータ解析が必要である。[参照元へ戻る] 5. ベイズ統計モデリングによる状態空間モデル ベイズ統計学に基づいてモデリングを行う手法のうち、時系列データに状態方程式と観測方程式を適用し、将来のある時点における観測値とその変動幅を予測するモデルを指す。[参照元へ戻る] 6. 脱分極 細胞膜内外の電位差（膜電位）が、細胞内にナトリウムイオンなどが流入することによってプラスの方向に変化すること。[参照元へ戻る] 7. 線条体 大脳基底核の主要な構成要素の1つであり、運動機能等への関与が知られている。大脳皮質からはグルタミン酸が放出されて線条体を興奮させることが知られており、線条体の90％を占めるとされる投射ニューロンであるmedium spiny neuronはGABAを伝達物質とする抑制性ニューロンであり、直接路と間接路にわかれるとされる。[参照元へ戻る] 8. 液体クロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー質量分析 物質の分離・分析手法の1つであり、移動相に液体を使用し、分離カラムを用いて対象成分を分離する手法を液体クロマトグラフィーと呼ぶ。この液体クロマトグラフィーに質量分析を接続した手法を液体クロマトグラフィー質量分析と呼ぶ。[参照元へ戻る] 9. 統計的解析（有意差検定） 2群あるいはそれ以上の多群のデータ間に差異があるかを統計学的に検定すること。母集団の分布が正規分布に従うと仮定して実施するパラメトリック検定の中で、2群間の検定に汎用される手法としてt検定などが知られる。検定を繰り返すことによって生じる「検定の多重性の問題」なども知られており、有意差検定を繰り返して行う際には注意が必要となる。[参照元へ戻る] 10. 自己相関 自己共分散を正規化したもので、時系列データにおいて生じる観測点間の相関性および類似性を指す。[参照元へ戻る] お問い合わせお問い合わせフォーム 産総研について アクセス 調達情報 研究成果検索 採用情報 報道・マスコミの方へ メディアライブラリー お問い合わせ English ニュース お知らせ一覧 研究成果一覧 イベント一覧 受賞一覧 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