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Kaneko, Yukinari Kato, Yoshinori Akiyama, Mitsunori Ikeguchi, Kenji Iwasaki, Terukazu Nogi 掲載雑誌：Acta Crystallographica Section D, Structural Biology DOI： https://doi.org/10.1107/S2059798321002527 研究費 ※本研究は、日本学術振興会科研費、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業（BINDS）、横浜市立大学 学術的研究推進事業 研究奨励プロジェクトの助成を受けて実施されました。 参　考 用語説明 *1　 X線結晶解析： 結晶化した物質にX線を照射して回折パターンを解析し、立体構造情報を取得する研究手法。タンパク質のような巨大な分子でも結晶化すれば、解析が可能になる。 *2　電子顕微鏡単粒子解析： タンパク質試料に電子線を照射して撮影した透過像から立体構造情報を取得する技術。重金属塩を満たしてタンパク質に浸潤させ形状を解析する負染色電子顕微鏡法*5とタンパク質を薄い氷の中に閉じ込めて構造を解析するクライオ電子顕微鏡法が代表的な解析手法である。 *3　 抗体ラベリング： 標的となるタンパク質に抗体を結合させる技術。立体構造解析で利用する際は、抗原結合部位を含む抗体の一部分を結合させる場合が多い。 *4　分子動力学シミュレーション： 計算機シミュレーションの１つで、分子を構成する各原子の運動を解析する研究手法。実験的に観測が難しい、分子の動的な性質を解析することが可能となる。 *5 負染色電子顕微鏡解析 タンパク質などの生体試料を重金属塩で染色すると、試料の隙間や周囲に重金属塩が浸潤する。染色後の試料に電子線を照射すると、主に電子散乱能の大きい重金属塩が形成するコントラストにより間接的にタンパク質など生体試料の形状を観察できる。透過像で実際に観察しているのは重金属塩の分布であることから負染色と呼ばれる。 図、画像、表 図1　外来の抗原配列を利用した抗体ラベリング法 標的タンパク質のループ領域に、外来の抗原配列を移植し、これを認識する抗体の断片を結合させることで、特異的に結合する抗体がない標的タンパク質にも抗体ラベリング法を用いることが可能になる。 抗体ラベリング法は、X線結晶解析では結晶化を促進させる効果があり、クライオ電子顕微鏡でも小さくて判別が難しいタンパク質を画像の中から見つけ出すのに役立つことから、立体構造解析での有用なツールとなっている。 図２　PA14タグの移植によって作製した抗体断片と標的タンパク質の複合体 水溶性のタンパク質を標的タンパク質として用いて、PA14タグの挿入と抗体断片の結合が可能かどうかを調べた。水色の標的タンパク質の表面からマジェンタ色のPA14タグが突き出し、濃淡２色のオレンジ色で示した抗体のFab断片が結合している様子が、X線結晶解析で明らかになった。 図3　PA14タグの配列と抗体との結合状態 PA14タグは、12個のアミノ酸からなるPA12タグの先頭にE（グルタミン酸）とG（グリシン）の2つのアミノ酸を付け加えたものである。新たに付け加えた2つのアミノ酸によって、抗体と結合した時のPA14タグは、最初と最後のアミノ酸が接近することが可能になり、全体では閉じたリング状の形をとる。このような性質があることで、分子表面から飛び出していないループ領域にもPA14タグを移植して抗体を結合させられることが、今回の研究でも確かめられた。 図4　タグの移植と抗体の結合によって生じる標的タンパク質の構造変化 以前の研究と今回の研究では、いずれも標的タンパク質のβ-ヘアピン領域の先端に抗原配列を移植した（左の図）。以前の研究で、PA12タグ（一般的には、PAタグと呼ぶ）を移植して抗体を結合させた時は、青色で示したβ-ストランド構造が壊れてしまう問題が起きた（真ん中の図）。今回、黄色の2つのアミノ酸を付け加えたPA14タグを移植して抗体断片を結合させたところ、青色のβ-ストランド構造は、タグを挿入していない野生型とよく似た状態に保たれることがわかった（右の図）。 図５　PA14タグによる抗体ラベリング法の電子顕微鏡解析での応用 PA14タグを膜タンパク質（膜に埋もれた状態ではたらくタンパク質）に移植し、抗体ラベリングを行った。この膜タンパク質の水溶性の領域にあるループにPA14タグを移植した変異体を細胞の中で発現させてから、界面活性剤で膜から溶かし出し、抗体断片を結合させた。この膜タンパク質と抗体断片の複合体に重金属溶液を添加し、負染色電子顕微鏡単粒子解析によって概形を調べた。抗体断片や膜タンパク質の水溶性ドメインの形状がはっきりとわかるデータが得られた。 研究体制 横浜市立大学 大学院生命医科学研究科　 　准教授　禾　晃和 　教授　池口　満徳 　助教　浴本　亨 筑波大学生存ダイナミクス研究センター 　教授　岩崎　憲治 大阪大学 蛋白質研究所 　特任研究員（常勤）　廣瀬　未果 京都大学 ウイルス・再生医科学研究所 　 　教授　秋山　芳展 　 　助教　檜作　洋平 東北大学未来科学技術共同研究センター / 大学院医学系研究科 　 　教授　加藤　幸成 参考文献 PAタグを利用した抗体ラベリング技術の開発の先行研究に関する論文 タイトル：Application of the NZ‐1 Fab as a crystallization chaperone for PA tag‐inserted target proteins 著者：Risako Tamura, Rika Oi, Satoko Akashi, Mika K. Kaneko, Yukinari Kato, Terukazu Nogi 掲載雑誌：Protein Science (2019) 28, 823-836 DOI：10.1002/pro.3580 記者発表資料 問い合わせ先 横浜市立大学  広報課 E-mail：[email protected] 生命医科学研究科 禾グループWEBサイト Tweet HOME ニュース一覧 タンパク質の抗体ラベリング技術を改良し、構造解析をアシスト 〜電子顕微鏡やX線結晶解析による構造決定を加速化〜 facebook twitter instagram youtube SNS一覧 YCUについて 大学紹介 法人情報 大学の取り組み 大学への寄付 学術院 100周年記念事業 大学の情報公開 研究・産学連携 研究・産学連携推進センター 研究ポリシー 知的財産・特許 学内の研究者の方へ（学内向け） 研究者データベース サイトマップ 学部・大学院 YCUの教養教育 国際教養学部 国際商学部 理学部 データサイエンス学部 医学部医学科 医学部看護学科 都市社会文化研究科 国際マネジメント研究科 生命ナノシステム科学研究科 生命医科学研究科 データサイエンス研究科 医学研究科医科学専攻 医学研究科看護学専攻 学生生活 奨学金・減免 部活・サークル ヨコ知リ ボランティア支援室 国際交流・留学 地域貢献センター 受験生の方へ 入試情報 イベント・説明会 大学院受験 大学院入試情報 キャリア・就職 キャリア支援センター 採用情報 お問い合わせ マスメディアの方へ 一般の方へ バナー広告募集 関連サイト 関連施設 附属病院 附属市民総合医療センター 学術情報センター（図書館） 先端医科学研究センター 木原生物学研究所 このサイトについて プライバシーポリシー Copyright© Yokohama City University. All rights reserved. PAGETOP close